科研 中科院成都生物所：甲烷氧化与硝化-反硝化耦合的微生物群落结构和功能的划分（国人佳作）

　　研究设计并构建了中空纤维膜生物膜反应器，以在低O2/CH4比和高脱氮速率下实现同步硝化-反硝化与甲烷氧化的耦合。反应器在三个O2/CH4比率下运行。当O2/CH4比率为1.47和2.1时，铵去除率分别达到77.5和95 mg/(L·d)。微生物群落分析表明，物理分区和不同O2/CH4比率阶段的曝气实现了微生物群落结构和功能的分区。qPCR联合功能基因分析表明，气体分布器曝气促进悬浮液/混合填料样品中自养氨氧化菌的富集，中空纤维膜曝气有利于甲烷氧化菌和异养硝化-好氧反硝化细菌的生长。本研究有助于进一步理解群落组装工艺及其关键驱动因素，为高效脱氮性能制定调控策略。

　　高负荷废水的传统处理通常结合了厌氧消化、硝化和反硝化过程。然而，厌氧消化后，C/N对反硝化而言往往偏低。因此，需要添加甲醇、葡萄糖和其他的简单有机物以加速反硝化速率，造成了额外的成本和出水中潜在剩余的COD污染物。近年来，一些研究发现，厌氧消化产生的甲烷能成为有助于氮去除的替代碳源。首先，甲烷被证明是参与硝酸盐/亚硝酸盐型反硝化（AME-D过程）的可能碳源，其中氮去除率能够达到549.6mg N /（L·d）。但由于甲烷的溶解度低，添加的甲烷不能得到充分的利用，导致了甲烷与硝酸盐的高消耗比（简称CH4-C/NO3--N比，范围为4.0至12.0），远高于1.27至1.39的理论值。为了更好的提高甲烷利用率和氮素去除率，采用膜生物膜反应器运行AME-D工艺。Modin等人表明，在反硝化效率方面，膜附着生物膜（CH4-C/NO3--N比值为2.2）优于悬浮培养物（CH4-C/NO3--N比值为8.7）。随后，他们证明氧化甲烷的最佳氧甲烷体积比（简称 O2/CH4比）为1.68，这与Sun等人揭示的结果一致（O2/CH4比值约为1.5）。

　　学界通过结合氨氧化进一步开发了应用于废水氮去除的AME-D工艺。Waki等人研究了甲烷氧化与硝化-反硝化相结合的每种脱氮途径的相对贡献，包括氨氧化、AME-D和anammox。它们还揭示了主要的甲烷营养菌（主要是甲基单胞菌属Methylomonas和甲基球菌属Methylococcus），反硝化菌（主要是热单胞菌Thermomonas、Hyphomicrobium、丛毛单胞菌属Comamonas和嗜甲基菌Methylophilus）和铵氧化细菌（AOB）（亚硝基单胞菌Nitrosomonas europaea和亚硝基单胞菌Nitrosomonas eutropha）。由于丰度较低，Anammox细菌没有被观察到。基于这一理论基础，膜生物膜反应器具有以甲烷为碳源同时硝化反硝化的巨大潜力，可以在不一样的区域实现相对独立的AME-D和氨氧化。因此，本研究设计并构建了一种中空纤维膜生物膜反应器（HfMBR），旨在以低O2/CH4比和CH4-C/NO3--N比同时硝化-反硝化耦合与甲烷氧化（ME-SND）耦合。

　　微生物群落组装过程是塑造群落结构的ECO过程。该过程具有确定性和随机的，可以通过零模型分析进行量化。确定性组装主要是通过环境选择做处理，某些因素可能是塑造群落结构的关键。环境选择可能诱导相对来说比较稳定的群落的组装。随机过程基本上涉及随机过程，例如物种形成，扩散，定植和生态漂移），当运行不稳定或添加新材料时常见于反应器系统中。HfMBR可能通过其特定的设计和运行过程在结构和功能上产生微生物群落的分区。然而，很少有报告研究了HfMBR中的微生物群落组装。通过了解运行参数（反应器设计和氧气供应）与群落组装过程之间的相关性，能够设计出更合适的策略来提高甲烷利用率和除氮效率。

　　调节供气量，使膜腔中的O2/CH4比为0.84、1.47和2.1，以此划分三个运行阶段。铵、硝酸盐和亚硝酸盐浓度随时间的变化如图1a所示。入口铵浓度控制在530 mg N/L。第一阶段出口氨浓度迅速下降至200 mg N/L，第二阶段维持在150 mg N/L，脱氮速率分别为77.5和95 mg/(L·d)。第三阶段铵浓度稳定在130 mg N/L。前两个阶段硝酸盐和亚硝酸盐的平均积累浓度分别为21.97和42.63 mg N/L。当O2/CH4比提高到2.1时，亚硝酸盐几乎被消除，硝酸盐积累到约45 mg N/L。三个阶段的平均总无机氮（TIN）去除率分别达到150、300和355 mg N/L。

　　相应的TIN去除效率分别为28.3%、56.67%和66.98%。在整一个完整的过程中，入口后和出口前检测到的pH值分别保持在7.5和5.8的水平。在入口之后和出口之前测量的DO（图1b）显示出对应于O2/CH4比率的增加趋势。DO变化趋势与铵出口浓度一致，可以解释一阶段和二阶段脱铵量增加的原因是供氧。在第三阶段，当DO超过3mg/L时，铵去除效率没有进一步提升，而亚硝酸盐被氧化，硝酸盐积累，这可能表明DO不是第三阶段氨氧化的限制条件。

　　Sun等人（2013）使用甲烷作为唯一碳源在中空纤维膜反应器中实现硝酸盐去除硝酸盐，当O2/CH4比约为1.5时，硝酸盐去除率最高，达到83%。然而，在他们的研究中，当O2/CH4比率持续增加时，硝酸盐去除速率会下降。Modin等人创建了物理分区，其中甲烷和氧气通过中空纤维膜渗透到膜表面上生长的生物膜，而含硝酸盐的液体被划分为厌氧腔。他们都以为甲烷氧化菌更倾向消耗中空纤维膜上生长的生物膜内部的氧气和甲烷，能够增强甲烷氧化过程并为反硝化作用创造厌氧微环境。当O2/CH4比值持续不断的增加时，反硝化作用却受到高溶解氧的抑制。相应地，最佳O2/CH4比率为1.68。然而，他们并没有揭示微生物生物膜隔室和反硝化菌对氧气的响应机制。我们的结果与上述报道基本一致。最佳O2/CH4比率介于1.47和2.1之间。在这项研究中，底物是铵，理论上氨氧化需要更多地氧气来完成。尽管如此，第三阶段的高氧注入并没有显著刺激氨氧化。随后，我们将研究微生物群落组装，以更好地了解氧气、功能微生物群和空间分布之间的关系。

　　图1 （a）铵、亚硝酸盐和硝酸盐浓度随培养时间和O2/CH4比率的阶段变化；（b）入口后（DO入口）和出口前（DO出口）的溶解氧浓度。

　　α多样性随时间和空间而变化（图2）。在空间维度上，中控纤维膜样本的α-多样性相比来说较低，但三部分没有表现出显著差异（P-welchst-test＞0.09）。在时间维度上，α多样性在三个阶段之间没有显著差异（P-welchst-test＞0.10），阶段二表现出最低的α多样性，而阶段一和三表现出相似的α多样性。然而，通过物理分区和O2/CH4比率阶段分组的微生物群落的PCoA分析显示出显著差异（分别为ANOSIM，R=0.2866，p=0.004和R=0.2586，p=0.004），如图3a和3b所示。中空样品中微生物群落的组成与液体/混合样品中的微生物群落有显著差异，因为来自中空的样品分别聚集在PCoA后面的组分1中，占总变异性的30.57%。各个阶段的微生物群落在PCoA中的各个阶段彼此分开，以下组1占总变异性的 32.35%。空间维度的α多样性和PCoA分析表明，注入甲烷和氧气的中空纤维膜使微生物群落更丰富。时间维度的α多样性和PCoA分析表明O2/CH4比是影响微生物群落结构的主要因素。

　　此外，我们测试了确定性和随机过程在塑造微生物群落方面的相对贡献。PERMDISP结果（图3c）表明，在所有中空和混合/液体群落中观察到的β多样性与基于Jaccard距离的零预期显著不同，这表明确定性过程在微生物群落组装中的主导作用，物理分区是塑造群落的主要环境选择因素。在时间维度上，观察到第一阶段和第二阶段样本的β多样性与零期望略有不同。同时，观察到的细菌群落和空模型模拟之间的β多样性在第三阶段显示出显著差异。因此，通过曝气向的群落组装过程可以定义为确定性过程，氧气量可能是选择群落物种的主要环境因素。

　　图2 （a）和（b）中空纤维膜、悬浮液体和混合填料微生物群落的α多样性；（c）和（d）三个O2/CH4比率阶段中微生物群落的α多样性；阶段1/2/3的中空纤维膜/悬浮液体/混合填料合表示三个O2/CH4比率阶段和各阶段收集的中空纤维膜/悬浮液体和混合填料代表性污泥样品。

　　图3 主坐标分析（PCoA）表征（a）中空纤维膜、悬浮液体和混合填料微生物群落的差异；（b）三个O2/CH4比率阶段下的微生物群落。（c）细菌群落β多样性与基于物理分区的零模型模拟之间差异的显著性检验。由于PCoA分析表明液体和混合填料没有显著差异。将二者归为一个区域（液体/混合）；（d）在不同O2/CH4比率阶段观测细菌群落β多样性与零模型模拟之间差异的显著性检验。

　　Ignavibacterium在中空膜具有较高的相对丰度，而在液体/混合填料中的丰度较低。属于Chlorobi组的Ignavibacterium充当清除者并在死亡的生物质和/或碳氢化合物降解的代谢物上茁壮成长。中空膜的Ignavibacterium的最高相对丰度表明生物量的高度积累，这表明中空膜具有高微生物富集的潜力。氨氧化细菌（AOB），如Nitrosomonadales和Nitrosomonas在液体/混合物中的含量更高，但它们的相对丰度之和小于1%。据报道，Commonadaceae能够在硝酸盐还原条件下降解p-烷基化芳香族化合物。Commonadaceae的许多菌株是反硝化菌，其中一些进行常规的厌氧异养反硝化，而另一些在好氧反硝化中发挥作用。Mesorhizobium和Hyphomicrobium是降解醋酸盐和甲醇的反硝化菌。据报道，在反硝化菌群中存在Rhodanobacter，该属中的许多成员都能够还原硝酸盐。Methylobacillus属于Methylophilacea属，是与甲烷氧化相关的主要甲基营养反硝化菌。异养反硝化菌，如Commonadaceae、Mesorhizobium、Comamonas、Rhodanobacter和Hyphomicrobium在液体/混合中更丰富，而甲基营养反硝化菌Methylobacillus在中空膜中的相对丰度更高。由于中空膜是发生甲烷氧化的主要区域，Methylobacillus倾向于固定在甲基碳的中心。

　　图4 （a）属水平微生物群落的时空分布；（b）Wilcoxon秩和检验表征中空纤维膜与悬浮液体/混合填料微生物之间的差异属。

　　研究尽管揭示了HfMBR中丰富的甲烷氧化菌群和一些氨氧化细菌和反硝化菌，但未分类的种群仍然限制了对于有助于去除氮污染物的微生物和生化过程的理解。为了更多地了解驱动甲烷和铵去除的功能微生物，研究对HfMBR中的甲烷氧化、硝化和反硝化相关的功能基因进行了qPCR分析。基于DNA的目标功能基因（包括pmoA、AOB-amoA、nxrB和nirS基因）定量以及通过16S rRNA测序预测的相应细菌种群如图5所示。负责编码甲烷单加氧酶的pmoA基因的绝对丰度范围为6.55×109到1.40×1011copies/g 样本（图5a-c）。在空间维度上，中空纤维膜微生物样品一般拥有最高的pmoA基因拷贝数。在时间维度上，中空纤维膜微生物样品在第一阶段的pmoA基因拷贝数最高，约为1.40×1011copies/g 样本，然后在第三阶段结束时下降到2.67×1010copies/g 样本。液体和混合填料中的最高拷贝数在第二阶段实现。基于16S rRNA基因测序的群落组成显示，主要的甲烷氧化菌是Methylocaldum、Methylobacter和Methylosinus。甲烷氧化菌的总相对丰度与pmoA基因拷贝基本一致（R2=0.4332，P=2.165E-06，如图6a所示），论证了主要甲烷氧化菌的识别和甲烷氧化菌的中空纤维膜偏好。 pmoA基因的全拷贝呈下降趋势，这原因是：1）高曝气速度缩短了甲烷暴露于甲烷氧化菌的时间；2）因为一些被AOB被证明能够将甲烷氧化成甲醇，因此，它们可能与甲烷氧化菌竞争底物。虽然铵浓度沿阶段继续下降（图1），但观察到硝酸盐随着阶段三的延长而增加，原因可能是缺乏通过甲烷氧化转化的有机物。因此，甲烷氧化的最佳O2/CH4比率建议为1.47，进一步提升O2/CH4比并不能促进甲烷氧化。

　　图5 功能微生物群的相对丰度及其通过qPCR测量的绝对丰度。线图表示功能基因拷贝数。条形图表示功能细菌的相对丰度。

　　图6（a）甲烷氧化菌与pmoA基因拷贝数、（b）AOB与AOB-amoA基因拷贝数、（c）NOB与nxrB基因拷贝数、（d）反硝化菌与nirS基因拷贝数的相对丰度的线性回归。y坐标中的数字表示功能基因的拷贝数。x坐标中的数字表明功能微生物的相对丰度（%）。

　　氨氧化细菌中与氨氧化相关的AOB-amoA基因丰度范围为109-1011copies/g样本，并且随着中空膜和液体中O2/CH4比的增加而略有增加（图5d-f）。在混合填料中观察到AOB-amoA基因丰富有明显的上涨的趋势，从2.95×109到1.71×1011copies/g 样本。液体/混合液中获得的最高拷贝数，达到1011copies/g 样本的数量级。通过qPCR检测到的AOA-amoA基因拷贝数为105-108copies/g 样本（图S2a），远低于AOB-amoA基因的拷贝数。HAO基因的拷贝数（如图S2b所示）随着 O2/CH4比率在中空膜和液体中趋于减少，它们在混合填料中保持在109copies/g 样本的数量级。化学自养硝化细菌，通常是Nitrosomonas，通过将氨氧化为亚硝酸盐来获取生长能量。另外，一些异养细菌也具有硝化作用。AMO和HAO基因是参与化学自养和异养氨氧化的基本功能基因。基于16S rRNA测序确定的群落中的AOB揭示了两个属于Nitrosomonadales的属，Nitrosomonas和一个未分类的Nitrosomonadales属。AOB相对丰度的变化趋势与液体/混合填料中amoA基因拷贝的趋势基本一致（R2=0.43，P=1.354E-06，图6b），说明液体/混合填料主要富集化能自养型AOB。中空膜微生物中化能自养型AOB的相对丰度降低，但amoA基因拷贝数呈阶段性增加趋势，这可能表明异养硝化细菌参与分布于中空膜附近。

　　nxrB基因范围为109-1010copies/g 样本，中空膜微生物中该基因拷贝数明显较高，液体和混合填料略微较少（图5g-i）。这在某种程度上预示着中空膜微生物可能倾向于富含能够氧化亚硝酸盐的细菌。我们之前的研究表明，铵可以被部分氧化，但当缺乏碳源时，亚硝酸盐会大量积累，这很好地支持了本研究中观察到的现象。AOB在液体/混合填料中高度富集，NOB倾向于粘附在中空膜处。由于NOB具有对有机物的偏好，进一步支持了异养硝化作用在中空膜附近的存在。

　　对反硝化过程中的限速酶基因nirS基因的检测发现，随着供氧量的增加，各部分nirS基因拷贝数均增加（图5j-l）。最高的提升发生在液体中，从105copies/g样本上升到 108copies/g 样本。nirS基因拷贝数在混合填料中维持在108-109copies/g样本的数量级，中空膜微生物最高拷贝数为2.28×1010copies/g 样本。nosZ基因拷贝数的趋势（图S2b）与中空膜和混合填料中nirS基因拷贝数的趋势一致。通过16S rRNA基因测序鉴定的主要反硝化菌是Rhodanobacter、Chitinophagaceae、Comamonadaceae、Mesorhizobium、Methylobacillus、Comamonas和Hyphomicrobium。然而，反硝化菌的总相对丰度在液体中最高，在中空膜中最低，这与nirS基因拷贝不一致（R2=0.0605，P=0.0884，图6d）。尽管在此总结了主要的反硝化菌，但这些反硝化菌的总相对丰度并不能代表系统中所有反硝化菌的总体趋势。qPCR揭示的nirS基因拷贝表明反硝化菌的数量随着曝气提升而增加，并且反硝化菌更喜欢粘附在中空膜上。这两个现象引起了人们的兴趣。反硝化菌聚集在中空膜的原因可能是中空膜处甲烷氧化产生的碳源充足。另一个问题则是怎么回事它们在高氧下更为活跃。其原因有两个假设：1）兼性厌氧反硝化菌可以在高碳和高溶解氧条件下进行有氧呼吸；2）好氧反硝化菌在好氧条件下能够直接进行硝酸盐还原。在第一个假设中，如果兼性厌氧反硝化菌以氧为电子受体进行呼吸，反硝化效率将受到高度抑制，TN则应积累。回顾图1中的氮转化和去除，TN没有积累。因此，好氧反硝化菌更有可能成为系统中的主要反硝化菌。上面确定的主要反硝化菌包括传统的兼性厌氧反硝化菌，如Rhodanobacter、Chitinophagaceae和Hyphomicrobium，同时也包括一些好氧反硝化菌，如Comamonadaceae、Comamonas和Mesorhizobium。此外，一种属于拟杆菌门的未分类细菌在各部分相对丰度较高，在第三阶段的相对丰度最高。该细菌可能在系统中具有一定的功能，但无法通过16S rRNA测序进行检验确定。宏基因组学将是一项进一步研究该体系中各种功能微生物的功能和相互作用的良好工具。

　　该研究通过物理分区和HfMBR中O2/CH4比率阶段的曝气调控对氮进行了有效去除，并揭示了微生物群落在结构和功能上的划分。研究通过气体分布器的曝气促进了液体/混合填料中自养AOB的富集。通过中空纤维膜注入O2和CH4促进甲烷氧化菌和异养硝化-好氧反硝化细菌的生长。尽管异养硝化-好氧反硝化细菌在第三阶段表现出高丰度，但碳源的缺乏限制了其脱氮能力，这是由O2/CH4比率为2.1时中空纤维膜的甲烷营养菌分散导致的。该研究表明，优化反应器设计可有效调控微生物群落组装。

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